FAQ
Häufige Fragen unserer Kunden
Speed congenics
Speed Congenics, auch als „Marker assisted selection protocol“ (MASP) bezeichnet, ist eine Methode zur beschleunigten Erzeugung von kongenen Mauslinien. Das sind solche, bei denen ein möglichst kleiner, definierter DNA-Abschnitt mit einem modifizierten Gen (im Weiteren als Target bezeichnet) von einem Donor-Stamm auf einen anderen Stamm (Rezipient) übertragen wurde. Der gesamte Rest des Genoms der kongenen Mauslinie besteht ausschließlich aus Rezipienten-DNA. Diese Übertragung erfolgt über eine schrittweise Rückkreuzung, bei der die Nachkommen einer Rückkreuzungsgeneration stets erneut mit Tieren des Rezipienten-Stammes verpaart werden. Von Generation zu Generation sinkt dadurch kontinuierlich der genomische Anteil an Donor-DNA.
Innerhalb jeder Rückkreuzungsgeneration werden zunächst diejenigen Individuen identifiziert, die das Target besitzen. Anschließend erfolgt bei diesen eine Genotypisierung mit Hilfe von 200 - 250 informativen STR-Markern (Short-Tandem-Repeats, Mikrosatelliten), die in regelmäßigen Abständen über alle Chromosomen verteilt vorliegen und zwischen Donor und Rezipient unterscheiden können. Für die Erzeugung der nächsten Rückkreuzungsgeneration wird das Tier eingesetzt, welches unter den Nachkommen bereits den höchsten genomischen Anteil des Rezipienten-Stammes aufweist. Dadurch lässt sich die Gesamtdauer der Rückkreuzung von ursprünglich 10 Generationen bei der klassischen Methode auf 5 – 6 Generationen verkürzen. Dies führt zu einer Zeitersparnis von 1-1,5 Jahren.
Soll ein vorliegender gemischter genetischer Hintergrund einer Mauslinie auf einen definierten Substamm eines Inzuchtstammes der Maus zurückgeführt werden, so wird die analoge Methode angewandt, wie sie auch für Speed congenics praktiziert wird.
Es gilt die Faustregel, dass je näher die zu trennenden Stämme miteinander verwandt sind, desto schwieriger gestaltet sich der Einsatz von SNPs. Sie können meist nur dann effektiv eingesetzt werden, wenn eine Rückkreuzung oder Vermischung zwischen verschiedenen Inzuchtstämmen vorliegt, z.B. 129 und C57BL/6. Soll aber beispielsweise ein Gemisch aus verschiedenen Substämmen von C57BL/6 korrigiert werden, so gibt es selbst beim Einsatz von sehr großen SNP-Panels nur vereinzelt Marker, welche für eine Unterscheidung zwischen Donor und Rezipient genutzt werden können.
Diese Einschränkung trifft auf die von der GVG genutzten STR-Marker nicht zu. Ihre Selektion erfolgte gezielt anhand der Maßgabe, auch zwischen sehr nahe verwandten Substämmen eines Inzuchtstammes differenzieren zu können. Das gilt nicht nur für Substämme von C57BL/6 zu, sondern gleichermaßen für Substämme von anderen Inzuchtstämmen, wie 129, BALB/c usw.
Eine besondere Herausforderung für die erfolgreiche Rückkreuzung stellt immer das Chromosom dar, auf dem sich das Target befindet (gekoppeltes Chromosom). Es werden mindestens zwei unabhängige Crossing over-Ereignisse im DNA-Bereich um das Target herum benötigt, jeweils eines upstream und downstream davon. Das Crossing over soll zudem so nahe wie möglich am Target erfolgen. Die Realität zeigt, dass solche Ereignisse relativ selten auftreten. Da das Konzept von Speed Congenics aber lediglich 5-6 Rückkreuzungsgenerationen vorsieht, ist bei Fokussierung auf den Wert für das Gesamtgenom vorhersehbar, dass bei Generation N5 auf dem gekoppelten Chromosom immer noch erhebliche Anteile an Donor-DNA (30%-40% und mehr) erhalten geblieben sind. Das ist ein sehr großes Cluster an nicht gewünschter Donor-DNA um das Target herum, welches dann auch nicht weiter reduziert werden kann!
Aus diesem Grund führen wir bei jeder Rückkreuzungsgeneration eine gezielte Suche nach Individuen durch, bei denen ein Crossing over möglichst nahe am Target stattgefunden hat. Wird beispielsweise in der N2-Generation bereits ein Tier mit einem Crossing over auf einer Seite vom Target gefunden, so ergeben sich für drei nachfolgende Rückkreuzungsgenerationen Chancen für die Detektion eines zweiten Crossing over auf der entgegengesetzten Seite vom Target. Parallel dazu erfolgt von Generation zu Generation ebenso eine stetige Verbesserung für die anderen Chromosomen.
Bei den Generationen N4 und N5 ist mit dieser Strategie die Situation für das gekoppelte Chromosom oftmals bereits zufriedenstellend gelöst. Hier wird dann unter den Nachkommen nach dem insgesamt „Besten“ gesucht.
Für die erfolgreiche Umsetzung einer solchen Screening-Strategie ist es notwendig, dass der Kunde folgende Informationen zur Verfügung stellt: Die Benennung des Chromosoms und die ungefähre Position des Targets auf dem Chromosom (in MBp ist ausreichend). Zusätzlich ist die Kenntnis der genauen Bezeichnung des Rezipienten-Stammes erforderlich. Bei der Verwendung von C57BL/6 ist es nicht ausreichend, lediglich auf den Zusatz „J“ oder „N“ zu verweisen. Sowohl „J“ und „N“ besitzen mehrere Substämme, die sich wiederum genetisch voneinander unterscheiden (JBomTac, JOlaHsd, JCrl, JRj, JRccHsd, NTac, NCrl, NHsd, NRj).
Weiterhin ist es sehr hilfreich, wenn eine DNA-Probe der F1-Generation zur Verfügung gestellt wird. Daran kann das Gesamtsystem für die Genotypisierung zunächst „geeicht“ werden, d.h. nach informativen (= heterozygoten) Markern gesucht werden, die für das konkrete Projekt genutzt werden können.
Es gibt Donor-Tiere, für welche der Integrationsort des Targets nicht bekannt ist. Mit Hilfe der Technologie-Plattform von GVG ist es unter Umständen möglich, mit dem Vorliegen von Genotypisierungs-Ergebnissen von etwa 7-10 Individuen das betroffene Chromosom zu identifizieren und die ungefähre Position des Targets auf dem Chromosom zu bestimmen. Darauf aufbauend ist es dann möglich, mit der beschriebenen Strategie des „besten Crossing over“ zielgerichtet fortzufahren. Sollte das gekoppelte Chromosom nicht bestimmbar sein, so wird nach dem genomweit am weitesten fortgeschrittenen „Besten“ gesucht.
Bei der gleichzeitigen Rückkreuzung von zwei oder mehr unterschiedlichen Targets in einer Linie gibt es erfahrungsgemäß mehrere Probleme. Zum einen benötigt man eine sehr große Anzahl an Nachkommen, um darunter solche zu identifizieren, die beide Targets gleichzeitig besitzen. Das kann in der Regel nur durch eine wesentlich größere Anzahl an Verpaarungen erzielt werden, oder indem nacheinander mehrmals verpaart wird.
Zum anderen zeigt sich, dass gewünschte Crossing over-Ereignisse meist nur bei einem der beiden Targets festgestellt werden können. Ein anderes Tier dagegen zeigt ein Crossing over für das zweite Target. Das mündet letztendlich zu Target-spezifischen Empfehlungen für die Weiterführung des Projektes und zu einem Aufblähen der Zucht von Generation zu Generation. Beide Situationen führen letztendlich zu einem erheblichen zeitlichen Verzug des gesamten Rückkreuzungsprojekts und zu einer sehr großen Anzahl an Individuen, die nicht weiter benötigt werden (Zuchtüberschuss).
Wir haben die Erfahrung gemacht, dass die optimale Lösung darin besteht, solche Projekte von Beginn an zu unterteilen, parallel jedes Target für sich gesondert zurück zu kreuzen und erst im Anschluss wieder zusammen zu führen. Das ist neben dem Zeitfaktor auch im Sinne von 3R, da für jedes Teilprojekt stets nur eine überschaubare Anzahl an Zuchtpaaren angesetzt werden muss und von der Gesamtzahl her gesehen somit erheblich weniger Tiere für einen erfolgreichen Abschluss des Projekts benötigt werden. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Strategie besteht darin, dass man jedes Target für sich als Einzelmutation im identischen Rezipientenstamm vorliegen hat und damit ggf. die Studie um vergleichende Tests zwischen Einzel- und Doppelmutanten erweitern kann.
Speed congenics wird der Bezeichnung “speed” nur dann Gerecht, wenn pro Generation aus einer begrenzten Anzahl an Kandidaten das Beste für die weitere Zucht ausgewählt werden kann. Diese Zahl liegt idealerweise zwischen 5 und 8. Rechnerisch gesehen ist jedes vierte Tier unter den Nachkommen männlich und gleichzeitig Target-positiv. Die Gesamtzahl der benötigten Nachkommen liegt also zwischen 20 (4 x 5) und 32 (4 x 8).
Würde man das eine beste Weibchen zur Verpaarung einsetzen, kann eine solche Anzahl von Nachkommen nur durch 3 zeitlich aufeinanderfolgende Verpaarungen erreicht werden. Ein Männchen dagegen kann ohne Probleme in einem kurzen Zeitraum mit 3 Weibchen parallel verpaart werden und züchtet die gleiche Anzahl von Nachkommen innerhalb einer einzigen Generation. Mit der ausschließlichen Nutzung von Männchen als Donor, erhält man identische Ergebnisse in einem dreifach kürzeren Zeitraum.
Als Besonderheit/Ausnahme kann die Erzeugung der Generation N2 angesehen werden. In diesem frühen Stadium der Rückkreuzung wird erstmals versucht, ein Tier zu identifizieren, bei welchem schon ein Crossing over-Ereignis so nahe wie möglich am Target stattgefunden hat. Die Chancen dafür sind umso größer, je mehr männliche (Target-positive) N2-Tiere man testen kann. Das kann man erreichen, indem man für die Verpaarung der F1-Weibchen mit Männchen des Rezipienten parallel eine größere Anzahl an Zuchtpaaren einplant. Dies ist aus Sicht der Genetik möglich, da alle Tiere der F1-Generation hinsichtlich des Anteils von Donor/Rezipient untereinander identisch sind. Für die darauffolgenden Rückkreuzungsgenerationen sollte dagegen dann nur noch das von uns anhand der Genotypisierungs-Ergebnisse empfohlene, beste Tier für die weiteren Verpaarungen eingesetzt werden.
Befindet sich das Target auf dem X-Chromosom, so muss für den Austausch der Donor-Anteile durch Rezipienten-DNA je ein Crossing over-Ereignis beiderseits des Targets stattgefunden haben. Das ist aber nur bei weiblichen Tieren möglich, da Männchen ihr nur einfach vorhandenes X-Chromosom unverändert weitergeben und somit zu keinem Fortschritt bei der Rückkreuzung beitragen. Es gilt die Regel, dass erst nach zufriedenstellender Situation auf dem X-Chromosom (Crossing over beiderseits des Targets) auf den Einsatz von männlichen Nachkommen gewechselt werden kann. Das ist frühestens ab der Rückkreuzungsgeneration N3 der Fall, meist später.
Es ist empfehlenswert, eine möglichst große Anzahl an Target-positiven weiblichen Tieren der N2-Generation zu testen, je mehr desto besser. Das kann man erreichen, indem für die Verpaarung von F1-Weibchen mit Männchen des Rezipienten-Stammes (nur diese Konstellation!) parallel eine größere Anzahl an Verpaarungen eingeplant wird. Dies ist aus fachlicher Sicht völlig unkritisch, da alle weiblichen Tiere der F1-Generation hinsichtlich des Anteils von Donor/Rezipient untereinander identisch sind (50 : 50).
Der erste Schritt bei der Rückkreuzung besteht in der Verpaarung eines Target-positiven Donors mit einem Tier des Rezipienten-Stammes. Alle Tiere der daraus entstehenden F1-Generation enthalten zu 50% die DNA des Donors und zu 50% die DNA des Rezipienten. War der Donor im Hinblick auf das zu übertragende Target homozygot, so enthalten alle Tiere der F1-Generation das Target und müssen daher nicht analysiert werden. Liegt dagegen beim Donor das Target in heterozygoter Form vor, so müssen unter den F1-Nachkomen zunächst diejenigen Tiere bestimmt werden, die auch das Target besitzen. Eine genomweite Genotypisierung ist in beiden Fällen noch nicht erforderlich.
Eine F1-DNA-Rückstellprobe sollte der GVG zur Verfügung gestellt werden, damit alle informativen, (=heterozygoten) STR-Marker identifiziert werden können.
Während der Rückkreuzung muss die Fixierung der beiden Geschlechtschromosomen des Rezipienten-Stammes erfolgen. Sofern verfügbar, ist generell nur die Verpaarung eines weiblichen Donor-Tieres mit einem männlichen Rezipienten zu empfehlen. Damit wird erreicht, dass alle männlichen F1-Nachkommen bereits das korrekte Y-Chromosom des Rezipienten besitzen. Das X-Chromosom dagegen ist noch vom Donor. Mit der empfohlenen Strategie, dass ausschließlich männliche Nachkommen für die Weiterzucht eingesetzt werden, besitzen dann alle männlichen Tiere der N2-Generation bereits auch das X-Chromosom des Rezipientenstammes. Beide Geschlechtschromosomen besitzen dann ausschließlich DNA des Rezipienten (siehe nachfolgende Abbildung).
Fehler werden dagegen häufig mit dem Y-Chromosom gemacht, wenn das Donor-Tier männlich ist und kein weibliches Donor-Tier zur Verfügung steht. In diesem Fall muss das Y-Chromosom des Rezipienten erst noch eingekreuzt werden. Das wird sehr oft vergessen. Ein „falsches“ Y-Chromosom hat unter Umständen durch epigenetische Effekte erhebliche Auswirkungen auf den Phänotyp selbst bei weiblichen Nachkommen, was die experimentellen Ergebnisse einer Studie verfälschen kann. Die Fixierung des Y-Chromosoms sollte unbedingt mit der N2-Generation erfolgen, indem hierfür parallel mehrere Zuchtpaare angesetzt werden, mit weiblichen Target-positiven Tieren der F1-Generation und männlichen Rezipienten-Tieren. Alle männlichen Individuen der daraus entstehenden N2-Generation besitzen damit ausschließlich das richtige Y-Chromosom. Für die Durchführung der Rückkreuzung ab der N2-Generation werden nur noch männliche Tiere eingesetzt. Damit bleibt das korrekte Y-Chromosom des Rezipienten-Stammes bei allen Nachkommen erhalten. Wird dieser Zeitpunkt der Fixierung des Y-Chromosoms verpasst, so kann das später nur unter erheblichen Einbußen der Geschwindigkeit bei der Rückkreuzung erfolgen, da dann das eine beste Weibchen mit einem Rezipienten-Männchen verpaart werden muss und unter den 6-8 Nachkommen des Wurfes nur sehr wenige Target-positive, männliche Tiere zu erwarten sind (siehe Punkt: Weshalb werden ausschließlich männliche Nachkommen eingesetzt).
Mit dem Buchstaben „F“ werden bei Inzuchtstämmen aufeinanderfolgende Generationen bezeichnet, welche ausschließlich durch Bruder-Schwester-Verpaarungen erzeugt werden. Bei der Rückkreuzung ist das Verpaarungsschema dagegen anders, hier wird stets ein Nachkomme der jeweiligen Rückkreuzungsgeneration mit einem Tier des Rezipienten verpaart. Zur Kenntlichmachung dieses Unterschiedes wird bei Speed congenics der Buchstabe „N“ vergeben. Nach erfolgreichem Abschluss eines solchen Projekts wird anschließend zu einer Bruder-Schwester-Verpaarung gewechselt. Ab diesem Zeitpunkt wird die Anzahl an Generationen der Zucht der neuen Linie über den Buchstaben „F“, kombiniert mit der jeweiligen Generationenzahl, gekennzeichnet.
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